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发表于 2016-11-9 16:39:42 |显示全部楼层
单核苷酸的多样性是遗传多样性的主要来源,是分子进化的动力和很多疾病的直接诱因,现阶段,人们已经发现了大量与人类疾病有关的单核苷酸变异,其中许多是功能获得性突变,会导致蛋白质的氨基酸置换或者形成转录因子的新结合位点。然而现有筛选方法(包括CRISPR、CRISPRi和RNAi)只能破坏一个基因或者改变其表达水平,难以引入一系列功能获得性突变进行高通量筛选,不过,这一现状或将得到改变。
近日,国际学术期刊Nature Methods发表了中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院健康科学研究所常兴研究组题为Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enablesefficient genomic diversification inmammalian cells 的最新研究成果,他们将活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(AID)与CRISPR-dCas9融合起来,打造了有效的遗传多样化工具,以便对功能性变异进行高通量筛选,这是一种体内实现高效率和高通量的DNA碱基编辑的新方法。
受“突变自我”机制的启发,博士研究生马云青和张佳元在研究员常兴的指导下发现,当把核酸酶缺陷的Cas9蛋白和诱导抗体高频突变的胞嘧啶脱氨酶AID融合后,在sgRNA靶向的基因组DNA上,胞嘧啶和鸟嘌呤可以随机地向其它三个碱基转变,这一新方法可以对细胞内的特定DNA序列进行多样化,完成遗传筛选,从而分析单核苷酸突变的功能。同时在一种多肽抑制剂的辅助下,dCas9-AID可以诱导特定的胞嘧啶向胸腺嘧啶转变,实现单碱基的精确编辑,研究人员在慢性粒细胞白血病细胞中用dCas9-AIDx靶标BCR-ABL,有效鉴定了赋予细胞伊马替尼抗性的已知突变和新突变。研究表明,dCas9-AID是一种相当实用的遗传学工具,可以在单碱基水平上筛选功能获得性变异。
该研究团队进一步证明,利用这一方法可以快速有效地模拟肿瘤细胞体内耐药机制的异质性,预测可能的肿瘤耐药性突变,进而改良小分子抑制剂和研究小分子与蛋白质靶点的相互作用。该研究成果为分子进化、基因治疗和在单碱基水平上分析基因调控元件等领域提供新的方法,据悉,该工作得到了中组部青年千人计划、科技部、国家自然科学基金委和上海市科委的相关资助。
另悉,上个月Nature Methods杂志也发布过关于CRISPR新研究的论文,其中,深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院开发的CRISPR“信号传导器”特别引人注目。深圳大学的研究人员给sgRNA带上能识别特定信号的改良版核糖开关,构建了基于CRISPRCCas9的“信号传导器”,这种“信号传导器”可以根据外界或内部信号调控内源基因的转录,实现对细胞信号通路和复杂分子网络的定向控制。
原文检索:《Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells》
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